Типичный лист, например лист табака с площадью
поверхности 200 см, содержит около 32 клеток. Верхний предел числа
клеток эпидермиса, которые могут быть инфицированы при механической
инокуляции в оптимальных условиях, точно не известен, но вряд ли он
превышает 10 клеток на лист. Поэтому в начале эксперимента в такой
системе инфицируется не более одной на каждые 10 клеток. При этом
даже у первично клеток синхронность инфекции, очевидно, не слишком
велика, особенно если для инокуляции используется интактный вирус.
Таким образом, ранние изменения и небольшой части инфицированных
клеток должны, вероятно, оставаться из-за огромного числа
неинфицированных клеток. Позже, с распространением инфекции,
образуется смешанная клеточная популяция, т. е. популяция, у которой
в рапных клетках протекают различные стадии инфекционного процесса.
Второе существенное неудобство данного метода (во
всяком случае, при исследовании инфекционного процесса в первые
несколько часов) связано с тем, что сама механическая инокуляция
сильно повреждает лист, вызывая изменения в дыхании, в потреблении
воды и, вероятно, во многих других процессах, включая и синтез
нуклеиновых кислот. В связи с этим особенно важную роль приобретает
использование соответствующим образом обработанных контрольных
листьев.
Еще одна трудность возникает при постановке
экспериментов, в которых в качестве инокулума используется вирус,
меченный радиоактивными изотопами. Большая часть вируса, нанесенного
на лист, не инфицирует клетки; в то же время значительная
(непостоянная по величине) часть вируса не может быть отмыта с листа
после инокуляции. Исследование дальнейшей судьбы: инфекционных
частиц сильно затрудняется из-за массы такого балластного
«неэффективного» инокулума, остающегося па листе.
Для некоторых экспериментов могут оказаться
полезными: следующие две модификации метода инокуляции листьев. У
листьев, выросших при определенных условиях, иногда удается
относительно легко отделить участки эпидермиса. Правда, таким путем
можно получить весьма ограниченное количество ткани, по этот прием
позволяет увеличить приблизительно в 8 раз число клеток,
инфицируемых вскоре после инокуляции. В сочетании с современными
микроаналитическими методами это дает возможность получить ценные
данные. Некоторые авторы применяли методы для заражения единичных
клеток листа (обычно это были клетки листовых волосков) и затем
следили за изменениями, происходящими непосредственно в живых
клетках, либо с помощью фазового контраста или ультрафиолетовой
микроскопии, либо пользуясь препаратами, окрашенными
флуоресцирующими антителами. Этот способ позволяет получать цепную
информацию, но применение его ограничивается микроскопическими
наблюдениями; для биохимических исследований он непригоден.
